研究内容
将化疗药物（CDs）和免疫检查点抑制剂（ICIs）通过腹腔共递送为卵巢癌（OC）患者腹膜转移的治疗结果带来希望。然而，当前的腹腔给药系统面临诸如淋巴引流快速清除药物、药物分布不均以及治疗剂不可控释放到腹腔等问题。因此，我们开发了一种由羧甲基壳聚糖（CMCS）和基于聚乳酸-多臂聚甘油的生物粘附纳米颗粒（BNPs）结合而成的可注射纳米水凝胶。该系统能够将CD和ICI共递送到腹腔空间以延长药物滞留时间。纳米水凝胶通过交联形成。通过可逆席夫碱键将BNPs上的醛基与CMCS上的胺基连接起来，分别将CD和ICI加载到BNPs和CMCS网络中。BNP/CMCS纳米水凝胶保持了生物分子的活性，并在7天内以持续的方式释放药物。通过与腹膜组织形成席夫碱，粘附性赋予BNPs在从纳米水凝胶释放后腹膜腔中的延长滞留时间。在小鼠模型中，载有紫杉醇（PTX）和抗PD-1抗体（αPD-1）的BNP/CMCS纳米水凝胶显著抑制了OC的腹膜转移，与所有其他测试组相比。此外，在治疗过程中未观察到载有PTX和αPD-1的纳米水凝胶的系统毒性，这支持了此递送系统的潜在转化应用。
研究背景
大多数卵巢癌患者在晚期被诊断，通常在肿瘤扩散到腹腔形成腹膜癌症时，预后不良且死亡率高。对于这类患者，细胞减灭手术和辅助化疗（主要为卡铂和紫杉醇的联合治疗）是首选治疗方案。然而，化疗常导致严重副作用，限制了药物的剂量和疗效。
免疫检查点抑制剂，尤其是PD-1/PD-L1抑制，提供了新的治疗选择，但卵巢癌的反应率较低，主要由于肿瘤新抗原缺乏和T细胞浸润有限。因此，需要增强肿瘤免疫原性。一种方法是利用化疗诱导的免疫原性细胞死亡（ICD），使肿瘤对免疫疗法更敏感。紫杉醇已被证明可以诱导ICD并增强PD-L1表达，但其全身给药的方式可能导致副作用增加。
相比之下，腹腔内给药（i.p.）能提高局部药物浓度，减少全身毒性。为了提高药物在腹腔内的滞留和分布，研究者们开发了基于聚乳酸-超支化聚甘油的生物粘附纳米颗粒（BNPs），显示出更好的治疗效果和较低的毒性。此外，水凝胶也被应用于腹膜药物递送，特别是针对大分子药物，具有高生物相容性和高装载效率。然而，疏水性药物在水凝胶中给药时仍面临挑战。因此，开发将药物负载的纳米或微粒整合在水凝胶中的制剂是一个理想的方向。
研究思路
为了实现疏水性药物紫杉醇（PTX）与免疫检查点抑制剂（ICIs）的共同递送，研究团队开发了一种基于生物纳米颗粒（BNPs）和羧甲基壳聚糖（CMCS）的纳米水凝胶。CMCS是一种经过化学改性的多糖，富含氨基，旨在增强在腹膜转移卵巢癌（OC）中的组合疗法效果。
研究假设如下：
纳米水凝胶（BNP/CMCS）通过BNPs与CMCS之间的席夫碱键自发形成。
PTX作为化疗药物成功封装在BNPs的疏水核心中，促进其在水凝胶中的递送。
αPD-1被加载到BNP/CMCS网络中。
通过腹腔注射加载药物的BNP/CMCS纳米水凝胶，αPD-1能够以受控速率释放，并在一周内在肿瘤中积累。纳米水凝胶降解后，BNPs将进一步附着于腹腔，使PTX能够实现长达2周的稳定和持续释放。研究认为，这种负载PTX和αPD-1的递送系统在抑制OC的腹膜转移方面比自由PTX和αPD-1的组合具有显著效果，可能是因为BNPs能够保护治疗剂免受淋巴引流的影响，同时以受控方式长时间释放疏水性药物和生物活性分子。
方案1.BNP/CMCS纳米水凝胶制备PTX和αPD-1对腹膜转移的疗效和增强疗效示意图
a(A)纳米水凝胶通过BNPs和CMCS之间的席夫碱键自发形成。将疏水药物PTX装载于BNPs中，以方便其在水凝胶中传递。此外，由于BNPs的生物粘附性，PTX/BNPs可以实现延长释放，减少淋巴引流。αPD-1加入纳米水凝胶的多孔结构中，通过αPD-1与网络中BNPs的相互作用来减少其突发释放。(B)BNP/CMCS纳米水凝胶共传递PTX和αPD-1可增强腹膜转移的治疗效果。
研究结果
图1.由BNPs和CMCS组成的纳米凝胶。(A)显示BNPs和CMCS混合后纳米凝胶凝胶化行为的图像。(B,C)室温下BNPs/CMCS纳米凝胶的凝胶化时间和形态。(D)BNPs的透射电子显微镜（TEM）图像及其尺寸分布。(E)通过BNPs（30mg/mL）和CMCS（30mg/mL）制备的冻干纳米凝胶的SEM评估，显示多孔网络结构(a)和纳米粒子的均匀分布(b)。比例尺分别为μm和10μm。
图2.BNP/CMCS纳米水凝胶的性质。(A)在37°C下，水凝胶的长期稳定性。将PLA-cy5封装在BNPs中以促进BNP/CMCS纳米水凝胶（PLA-cy5/BNPs：30mg/mL，CMCS：30mg/mL）的可视化。(B)水凝胶的膨胀速率（n=3）。(C)BNP/CMCS纳米水凝胶表现出优异的可注射性（BNP：30mg/mL，CMCS：30mg/mL）。(D)水凝胶的粘度曲线。(E)BNP/CMCS纳米水凝胶的自我修复性能。(F)BNP/CMCS纳米水凝胶的流变学特性，在交替应变下存储模量(G′)和损耗模量(G″)。(G,H)随着剪切应变和角频率变化，BNP/CMCS纳米水凝胶的流变学表征。
图3.BNP/CMCS纳米水凝胶的生物相容性评估。(A)在37°C下，PBS或含0.5mg/mL溶菌酶的PBS中BNP/CMCS纳米水凝胶的体外降解动力学。黄芩素被加载在BNPs中作为颜色指示剂（n=3）。(B)在有或无溶菌酶处理5天后，BNP/CMCS纳米水凝胶的扫描电子显微镜图像。(C-E)使用小鼠成纤维细胞3T3细胞对BNPs、CMCS和BNP/CMCS纳米水凝胶的细胞毒性进行评估（n=5）。(F)BNP/CMCS纳米水凝胶及其组成成分的溶血活性（n=3）。\*p0.05，与未处理组比较。
图4.BNP/CMCS纳米凝胶递送PTX和αPD-1。(A)PTX/BNPs的透射电子显微镜图像及其大小分布。(B)PTX/BNPs的特性表。(C)冻干PTX/BNP/CMCS纳米凝胶的扫描电子显微镜图像展示了网络结构(a)和纳米颗粒的分布(b)。a的标尺为μm，b的标尺为10μm。(D)PTX从PTX/BNPs和PTX/BNP/CMCS纳米凝胶的体外释放曲线（n=3）。(E)在2天内，等量的PTX从自由PTX、PTX/BNPs和PTX/BNP/CMCS纳米凝胶孵育后ID-8细胞的存活率（n=5）。(F,G)在48小时内，用20μM自由PTX或从PTX/BNPs和PTX/BNP/CMCS释放的PTX处理ID-8细胞后细胞外HMGB1和ATP水平（n=3）。(H)BNP/CNCS纳米凝胶中αPD-1的体外释放模式（n=3）。(I)αPD-1在BNP/CMCS纳米凝胶中的活性得以维持（n=3）。**p0.01,***p0..
图5.BNP/CMCS纳米水凝胶体内保留评估。(A)应用抗体、纳米颗粒或BNP/CMCS纳米水凝胶后，在腹部区域不同时间点对αPD-1-cy5.5和PLA-cy7.5/BNPs的保留情况。(B,C)腹部区域内保留的αPD-1-cy5.5和PLA-cy7.5/BNPs的量化荧光。实验中，通过腹腔注射给予小鼠等剂量的μLPLA-cy7.5/BNP/CMCS或BNP/CMCS
αPD-1-cy5.5纳米水凝胶，或者等剂量的αPD-1-cy5.5或PLA-cy7.5/BNPs。所有数据均进行了三重重复（n=3）。*p0.05,**p0.01。图6.装载PTX和αPD-1的BNP/CMCS纳米凝胶在携带转移性OC小鼠中的治疗效果。(A)实验设计示意图。(B)作为肿瘤负荷指标的小鼠体重变化和(C)不同治疗组（PBS、PTX、αPD-1、PTX+αPD-1、BNP/CMCS、PTX+αPD-1+BNP/CMCS、PTX/BNP/CMCS
αPD-1纳米凝胶）的生存曲线。数据表示为平均值±标准误（SEM），每组n=7或8，统计分析与PTX+αPD-1组进行比较。(D)接受不同治疗的小鼠腹水体积和代表性的图片（每组n=7或8，数据表示为平均值±SEM）。(E)HE染色（比例尺，μm）和(F)Ki67染色（比例尺，50μm）来自接受不同治疗小鼠的肿瘤组织。(G)Ki67阳性区域的量化。(H、I)腹水中HMGB1和ATP的浓度（每组n=3，数据表示为平均值±SEM）。所有样本在第48天收集。*p0.05，**p0.01，***p0.。图7.PTX和αPD-1负载BNP/CMCS纳米水凝胶治疗后腹水和肿瘤中免疫细胞的浸润和激活。在ID-8肿瘤建立模型的小鼠上按照图6A描述的方法进行治疗，并在第48天收集样本进行流式细胞术分析。收集腹水和肿瘤细胞并使用流式细胞术进行分析。腹水中CD4+T细胞（A,B）的百分比，CD8+T细胞（C,D）的百分比以及肿瘤内效应记忆（CD44highCD62Llow）CD8+T细胞（E,F）的百分比。肿瘤中CD4+T细胞（G,H）和CD8+T细胞（I,J）的比例。显示平均值±标准误差，每组小鼠n=3只。**p0.01,***p0..
研究结论
在本研究中，我们开发了一种由可逆Schiff基团在CMCS和PLA-HPG为基础的BNPs之间形成的注射用纳米凝胶。这种凝胶可以将难溶于水的药物PTX和αPD-1分别装载到纳米颗粒和CMCS聚合物网络中。通过结合BNPs和凝胶作为载体的优点，我们在腹腔内实现了PTX和αPD-1的延长滞留时间和可控释放，从而提高了对具有腹膜转移的卵巢癌治疗的协同效果，并降低了副作用。
推荐理由
本研究开发的注射型BNP/CMCS纳米水凝胶为腹膜转移治疗提供了一种新的策略，通过延长药物在腹膜腔内的滞留时间和控制释放，增强了化疗和免疫治疗的协同效应，同时减少了系统毒性，为OC腹膜转移治疗提供了潜在的临床应用前景。
参考文献